Proteinler, çeşitli etkilerle denatüre olurlar. Bir proteinin denatürasyonu, molekülündeki yan bağların yıkılması ile polipeptit zincirin katlarının açılması, gelişigüzel kangallanım yapısına dönüşmesi, sonra yeni bir biçimde yeniden katlanması olayıdır.
Bir proteinin denatürasyonu, proteinin tersiyer yapısının bozulması, sekonder ve primer yapısının korunması biçiminde olursa reversibl (geri dönüşümlü)’dür. Denatüre olmuş bir proteinin tekrar eski haline dönmesine renatürasyon denir:
Bir proteinin denatürasyonu, proteinin tersiyer ve sekonder yapısının bozulması, yalnızca primer yapısının korunması biçiminde olursa irreversibl (geri dönüşümsüz)’dür.
Bir proteinin denatüre olmasıyla fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişmeler görülür. Proteinin çözünürlüğü çok azalır, biyolojik aktivitesi kaybolur.
Bir proteinin denatürasyonu, çoğu kez hidrojen bağlarını yıkan etkilerle olur. Bir proteinin denatürasyonuna neden olan etkiler şunlardır: Isı, X-ışını ve UV ışınlar, ultrason, uzun süreli çalkalamalar, tekrar tekrar dondurup eritmeler, asit etkisi, alkali etkisi, organik çözücülerin etkisi, derişik üre ve guanidin-HCl etkisi, salisilik asit gibi aromatik asitlerin etkisi, dodesil sülfat gibi deterjanların etkisi.
2) Proteinler, amfoter maddeler yani amfoter elektrolit veya amfolittirler; hem asit hem baz gibi davranma özellikleri vardır.
Bir protein molekülü, her protein için farklı ve karakteristik olan, proteindeki elektriksel yüke sahip R- gruplarının sayıları ve elektriksel yüklerinin çeşidi tarafından belirlenen ve izoelektrik nokta diye tanımlanan bir pH değerinde iyonlaşmış fakat dış ortama karşı elektriksel yönden nötral bir yapıdadır:
10
(H2N-⋅⋅⋅⋅⋅-COOH) ↔(H3N+-⋅⋅⋅⋅-COO−)
Bir protein molekülü, izoelektrik noktasından düşük pH ortamında pozitif yüklü katyon (H3N+-⋅⋅⋅⋅-COOH) şeklinde bulunur; izoelektrik noktasından yüksek pH ortamında ise negatif yüklü anyon (H2N-⋅⋅⋅⋅-COO−) şeklinde bulunur.
Proteinler, amfolit olma özellikleriyle ilgili olarak da çeşitli özelliklere sahiptirler:
a) Proteinlerin hem baz hem asit bağlama özellikleri vardır. Bir proteinin baz bağlama yeteneği, amino asit kalıntılarının R- yan zincirlerindeki asidik grupların sayısına bağlıdır; asit bağlama yeteneği de amino asit kalıntılarının R- yan zincirlerindeki bazik grupların sayısına bağlıdır.
b) Proteinlerin hem negatif iyon hem pozitif iyon bağlama özellikleri vardır. Proteinlere bağlanan birçok iyon suda çözünmez tuz oluşturur ve protein çöktürücü olarak etkilidirler.
Triklor asetik asit, pikrik asit, tungstik asit gibi çok kullanılan protein çöktürücülerinde asitlerin anyonu, katyonlaşmış proteinlerle birleşir.
Hg2+, Fe3+, Zn2+ gibi ağır metal katyonları anyonlaşmış proteinlerle birleşir ve protein çöktürücü olarak etki ederler.
Cu2+, Ni2+ gibi bazı ağır metal katyonları, geleneksel tuz oluşumu yerine proteinle koordinasyon kompleksleri oluştururlar.
c) Proteinlerin su bağlama ve bağlı suyu verme yetenekleri vardır. 1g protein, yaklaşık 0,3-0,5 g su bağlar.
Etanol, aseton, nötral tuzlar gibi çok hidrofil maddeler, bir proteinin bağladığı suyu çekerek protein çöktürücü olarak etki ederler.
d) Proteinler, elektriksel alanda farklı hızlarda göç ederler. Bu göç, izoelektrik noktalarından düşük pH’larda katoda; izoelektrik noktalarından yüksek pH’larda anodadır. Proteinlerin elektriksel alanda göçme hızı, net elektrik yüklerine ve ortamın pH değerine bağlıdır. Bir protein, elektriksel alanda, izoelektrik noktasına eşit pH ortamında her iki kutup tarafından eşit kuvvetlerle çekilir; hiç bir kutba göç etmez; hareketsiz kalır.
3) Proteinler, polipeptit zincirindeki peptit bağlarının su girişi ile yıkılması sonucu hidroliz olurlar. Proteinlerin kısmi hidrolizi ile proteozlar, peptonlar ve peptitler oluşur; tam hidrolizi ile amino asitler oluşur.
Proteinlerin hidrolizi, kaynatma, asit etkisi ve enzim etkisiyle olabilir. .................More Read....

GLOBAL DOCUMENT

AMINO ACID ANALYSIS

Amino acid analysis refers to the methodology used to determine the amino acid composition or content of proteins, peptides, and other pharmaceutical preparations. Proteins and peptides are macromolecules consisting of covalently bonded amino acid residues organized as a linear polymer. The sequence of the amino acids in a protein or peptide determines the properties of the molecule. Proteins are considered large molecules that commonly exist as folded structures with a specific conformation, while peptides are smaller and may consist of only a few amino acids. Amino acid analysis can be used to quantify protein and peptides, to determine the identity of proteins or peptides based on their amino acid composition, to support protein and peptide structure analysis, to evaluate fragmentation strategies for peptide mapping, and to detect atypical amino acids that might be present in a protein or peptide. It is necessary to hydrolyze a protein/peptide to its individual amino acid constituents before amino acid analysis. Following protein/peptide hydrolysis, the amino acid analysis procedure can be the same as that practiced for free amino acids in other pharmaceutical preparations. The amino acid constituents of the test sample are typically derivatized for analysis.

Apparatus

Methods used for amino acid analysis are usually based on a chromatographic separation of the amino acids present in the test sample. Current techniques take advantage of the automated chromatographic instrumentation designed for analytical methodologies. An amino acid analysis instrument will typically be a low-pressure or high-pressure liquid chromatograph capable of generating mobile phase gradients that separate the amino acid analytes on a chromatographic column. The instrument must have postcolumn derivatization2

capability, unless the sample is analyzed using precolumn derivatization. The detector is usually an ultraviolet-visible or fluorescence detector depending on the derivatization method used. A recording device (e.g., integrator) is used for transforming the analog signal from the detector and for quantitation. It is preferred that instrumentation be dedicated particularly for amino acid analysis.

General Precautions

Background contamination is always a concern for the analyst in performing amino acid analysis. High purity reagents are necessary (e.g., low purity hydrochloric acid can contribute to glycine contamination). Analytical reagents are changed routinely every few weeks using only high-pressure liquid chromatography (HPLC) grade solvents. Potential microbial contamination and foreign material that might be present in the solvents are reduced by filtering solvents before use, keeping solvent reservoirs covered, and not placing amino acid analysis instrumentation in direct sunlight.

Laboratory practices can determine the quality of the amino acid analysis. Place the instrumentation in a low traffic area of the laboratory. Keep the laboratory clean. Clean and calibrate pipets according to a maintenance schedule. Keep pipet tips in a covered box; the analysts may not handle pipet tips with their hands. The analysts may wear powder-free latex or equivalent gloves. Limit the number of times a test sample vial is opened and closed because dust can contribute to elevated levels of glycine, serine, and alanine.

A well-maintained instrument is necessary for acceptable amino acid analysis results. If the instrument is used on a routine basis, it is to be checked daily for leaks, detector and lamp stability, and the ability of the column to maintain resolution of the individual amino acids. Clean or replace all instrument filters and other maintenance items on a routine schedule.

Reference Standard Material

Acceptable amino acid standards are commercially available for amino acid analysis and typically consist of an aqueous mixture of amino acids. When 3

determining amino acid composition, protein or peptide standards are analyzed with the test material as a control to demonstrate the integrity of the entire procedure. Highly purified bovine serum albumin has been used as a protein standard for this purpose.

Calibration of Instrumentation

Calibration of amino acid analysis instrumentation typically involves analyzing the amino acid standard, which consists of a mixture of amino acids at a number of concentrations, to determine the response factor and range of analysis for each amino acid. The concentration of each amino acid in the standard is known. In the calibration procedure, the analyst dilutes the amino acid standard to several different analyte levels within the expected linear range .................More Read....

Revised 2/21/02 with JP comments

TOTAL PROTEIN ASSAY

The following procedures are provided as illustrations of the determination of total protein content in pharmacopeial preparations. Other techniques, such as HPLC, are also acceptable if total protein recovery is demonstrated. Many of the total protein assay methods described below can be performed successfully using kits from commercial sources.

N

OTE—Where water is required, use distilled water.

Method 1

Protein in solution absorbs UV light at a wavelength of 280 nm, due to the presence of aromatic amino acids, mainly tyrosine and tryptophan. This property is the basis of this method. Protein determination at 280 nm is mainly a function of the tyrosine and tryptophan content of the protein. If the buffer used to dissolve the protein has a high absorbance relative to that of water, there is an interfering substance in the buffer. This interference can be compensated for when the spectrophotometer is adjusted to zero buffer absorbance. If the interference results in a large absorbance that challenges the limit of sensitivity of the spectrophotometer, the results may be compromised. Furthermore, at low concentrations protein can be absorbed onto the cuvette, thereby reducing the content in solution. This can be prevented by preparing samples at higher concentrations or by using a nonionic detergent in the preparation.

N

OTE—Keep the Test Solution, the Standard Solution, and the buffer at the same temperature during testing.

Standard Solution

—Prepare a solution of the Reference Standard or Reference Material for the protein under test in the same buffer and at the same concentration as the Test Solution.2

Test Solution

—Dissolve a suitable quantity of the protein under test in the appropriate buffer to obtain a solution having a concentration of 0.2 to 2 mg per mL.

Procedure

—Concomitantly determine the absorbances of the Standard Solution and the Test Solution in quartz cells at a wavelength of 280 nm, with a suitable spectrophotometer, using the buffer as the blank. To obtain accurate results, the response should be linear in the range of protein concentrations to be assayed.

Light-Scattering

—The accuracy of the UV spectroscopic determination of protein can be decreased by the scattering of light by the test specimen. If the proteins in solution exist as particles comparable in size to the wavelength of the measuring light (250 to 300 nm), scattering of the light beam results in an apparent increase in absorbance of the test specimen. To calculate the absorbance at 280 nm due to light-scattering, determine the absorbances of the .................More Read....