• Biochemistry Protocols – Biyokimya Protokoller

    Laboratuvar ve İşletmelerde Uyulması Gereken Emniyetli Çalışma Kuralları

     

    Laboratuvar ve İşletmelerde Uyulması Gereken Emniyetli Çalışma Kuralları

    Genel Laboratuvar Kuralları
    01. İdari bölüm, fiziksel, kimyasal ve mikrobiyoloji analiz laboratuvar bölümleri ayrı birimler halinde planlanmalıdır.
    02. Laboratuvarlar yapılan analizin özelliğine uygun bir şekilde planlanmalı ve çalışmalıdır.
    03. Personel için yeteri kadar soyunma dolabı bulundurulmalı, kadın ve erkek personel için soyunma odaları ve sosyal alan düşünülmelidir. Laboratuvara çanta, palto, hırka, mont ve gereksiz malzeme getirilmemelidir.
    04. Laboratuvarlar özel çevre koşulları gerektiren analizlerde bu koşulları kontrol etmeye yarayan alet ¬ ekipmanlarla donatılmış olarak ayrı bölümler halinde planlanmalıdır.
    05. Laboratuvarlar toz, nem, buhar, titreşim, elektromanyetik etkenler ve zararlı canlılar gibi olumsuz etmenlerden korunmalıdır. Çalışma alanları 20ºC sıcaklıkta sabit tutulmalıdır.
    06. Analiz yapılan bölümler, çalışan personelin rahatça hareket etmesine olanak sağlayacak genişlikte planlanmalıdır.
    07. Boru sistemleri, radyatörler, aydınlatma sistem ve bağlantıları ile diğer servis noktaları kolay temizlenecek biçimde tasarlanmalı, duvarlar, taban ve tavanlarkolay temizlenir ve gerektiğinde dezenfekte edilir özellikte olmalıdır.
    08. Aydınlatma, ısıtma ve havalandırma sistemleri yapılacak analizleri doğrudan veya dolaylı olarak etkilemeyecek nitelikte olmalıdır.
    09. Laboratuvarda ilk yardım için gerekli ilaç ve malzeme bulunan bir dolap ve ilk yardım talimatı bulunmalıdır.
    10. Laboratuvarda yangına karşı gerekli önlemler alınmalı, bu konuda mutlaka itfaiyeden uygunluk belgesi alınmalıdır.
    11. Laboratuvar binasının çevresinde kirliliğe yol açacak çöp, atık yığınları, su birikintisi ve zararlı canlıların yerleşmesine uygun ortamlar bulunmamalıdır.
    12. Personelin iş güvenliği için uygun giysi ve donanım kullanması sağlanmalıdır. Laboratuvarda mutlaka laboratuvar önlüğü ile çalışılmalıdır. Laboratuvar önlüğü tercihan yanmayan kumaştan, normal uzunlukta ve uygun bedende olmalıdır.
    13.Uzun saçlar toplanmalı, ya topuz yapılmalı veya yanmaz bone içine alınmalıdır. Ayakkabılar laboratuvarda çalışmaya uygun olmalı, burnu açık ayakkabı giyilmemelidir.
    Tuvaletler laboratuvar bölümlerine açılmamalıdır.
    14. Laboratuvarda herhangi birşey yenilip içilmemeli (özellikle sigara), çalışırken eller yüze sürülmemeli, ağıza herhangi birşey alınmamalıdır.
    15. Laboratuvarın her bölümünde temizlik, sanitasyon dezenfeksiyon işlemleri yazılı talimatlara göre periyodik olarak yapılmalı, kayıtları tutulmalıdır.
    16. Çalışan personelin periyodik sağlık kontrolleri yapılmalı, bulaşıcı bir hastalığı olan veya taşıyıcı olduğu belirlenen personel çalıştırılmamalıdır.
    17. Kullanıldıktan sonra her bir eşya, alet veya cihaz belli ve yöntemine uygun biçimde temizlenerek yerlerine kaldırılmalıdır.
    18. Laboratuvarların giriş ¬ çıkışı denetlenmeli ve analiz yapılan bölümlere çalışanlar dışında kişilerin girmeleri engellenmelidir.
    19. Laboratuvarın faaliyet gösterdiği konulara göre ortaya çıkan atıklar doğrudan alıcı ortama verilmemeli, tekniğine ve mevzuata uygun bir biçimde etkisiz hale getirilmelidir.
    20. Atılacak katı maddeler çöp kutusuna atılmalıdır. İşi bitmiş, içinde sıvı bulunan beher, erlenmayer, tüp gibi temizlenecek cam kaplar da lavaboya konulmalı, masa üzerinde bırakılmamalıdır.
    21. Su, gaz muslukları ve elektrik düğmeleri, çalışılmadığı hallerde kapatılmalıdır.
    Malzemeler kendi malınızmış gibi kullanılmalıdır.
    22. Çalışmalarda dikkat ve itina ön planda tutulmalıdır.
    23. Laboratuvarda başkalarının da çalıştığı düşünülerek gürültü yapılmamalıdır. Asla şaka yapılmamalıdır.
    24. Laboratuvarda meydana gelen her türlü olay, laboratuvarı yönetenlere anında haber verilmelidir.
    25. Laboratuvarı yönetenlerin izni olmadan hiçbir madde ve malzeme laboratuvardan dışarı çıkarılmamalıdır.
    26. Katı haldeki maddeler şişelerden daima temiz bir spatül veya kaşıkla alınmalıdır. Aynı kaşık temizlenmeden başka bir madde içine sokulmamalıdır. Şişe kapakları hiçbir zaman alt tarafları ile masa üzerine konulmamalıdır. Aksi taktirde, kapak yabancı maddelerle kirleneceği için tekrar şişeye yerleştirilince bu yabancı maddeler şişe içindeki saf madde veya çözelti ile temas edip, onu bozabilir.
    27. Cam kapaklı şişeler açılmazlarsa, böyle hallerde şişe kapağına bir tahta parçası ile hafifçe vurularak gevşetilir. Bu fayda etmediği .................More Read....

    By admin on 19 Ekim 2011 | Biochemistry Protocols - Biyokimya Protokoller
    Etiketler:

    Total RNA isolation protocol

    Total RNA isolation protocol

    The procedure is suitable for all types of tissues from wide variety of animal (and blood) and plant species. All steps are performed at weak acid pH (MOPS or MES free acids) and at room temperature (RT) (without ice) and without DEPC-treated water. RNA precipitate with lithium chloride (LiCl) for increased stability of the RNA preparation and improvement of cDNA synthesis. The following protocol is designed for small and large tissue samples (tissue volume 10-200 μl), which normally yield about 10-500 μg of total RNA.

    Materials for total RNA isolation

    • GuTC extraction buffer: 2.5 M guanidine thiocyanate, 0.1 M LiCl, 10 mM EDTA, 0.1 M MOPS, pH 4.6;
    • Phenol, pH 4.5-6.6;
    • Chloroform-isoamyl alcohol mix (24:1);
    • 100% isopropanol (isopropyl alcohol, 2-propanol);
    • 70% ethanol;
    • 10 M LiCl;
    • Fresh Milli-Q water (or Milli-Q ultrapure BioPak water) or autoclaved 1xTE (0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.0) or 1xTHE (0.1 mM EDTA, 2 mM Tris, 8 mM HEPES, pH 7.0). When an ultrafiltration cartridge (BioPak) is utilized at the point-of-use, the water is suitable for genomics applications (quality at least equivalent to DEPC-treated water) and cell culture.
    1. 2 ml Eppendorf Safe-Lock tube with tissue sample and glass boll freeze at -80°C, grind in the MM300 Mixer Mill for 5 min at 30 Hz.
    2. In 2 ml tube with mechanically disrupted tissue sample add fresh 1.5 ml GuTC extraction buffer, vortex very well, and incubate the samples at 60°C for 10-30 minutes. Spin at maximum speed on table microcentrifuge for 5-10 minutes.
    3. Transfer 1 ml of the supernatant (the pellet contains polysaccharides and high molecular weight DNA) to a fresh tube with 500 μl of phenol, vortex very well and incubate for 5 minutes.
    4. Add 400 μl of chloroform-isoamyl alcohol, vortex very well for 1 minute creating an emulsion (or in the MM300 Mixer Mill at 30 Hz). Spin at maximum speed on table microcentrifuge for 3 minutes at RT.
    5. Transfer the aqueous phase to a fresh microcentrifuge 2 ml tube with 700 μl of chloroform-isoamyl alcohol and vortex well (in the MM300 Mixer Mill for 2 min at 30 Hz). Spin at maximum speed on table microcentrifuge for 2 minutes at RT.
    6. Transfer the aqueous phase to a fresh microcentrifuge 2 ml tube with an equal volume of 2-propanol and mix well. Spin at maximum speed on table microcentrifuge at room temperature for 2 minutes. Wash the pellet once with 1.5 ml 70% ethanol. Spin immediately at maximum speed on table microcentrifuge at room temperature for 2 minutes.
    7. Dissolve the pellet (do not dry) in 400 μl 1xTE at 55°С about 10-20 min, with vortex.
    8. Optional: add an equal volume of 10 M lithium chloride, mix well, and chill the solution at -20°C for several hours (overnight). Spin at maximum speed on table microcentrifuge for 10 minutes. Carefully remove and discard (or save, Fig.1) supernatant (contains: small RNA < 200 nt and DNA). Wash pellet with 1 ml 70% ethanol, vortex well, microcentrifuge, discard the ethanol, don’t dry the pellet. Dissolve the pellet in 200-400 μl fresh milliQ water (BioPak) or 1xTE.

    Load 5 μl of the solution onto a standard (non-denaturing) 1.5 % agarose gel with 0.5x TBE buffer to check the amount and integrity of the RNA. Add ethidium bromide (EtBr) to the gel to avoid the additional (potentially RNAse-prone) step of gel staining. Load a known amount of DNA in a neighboring lane to use as standard for determining the RNA concentration. Intact RNA should exhibit sharp band(s) of ribosomal RNA.

    Notes

    1. There is widespread belief that RNA is very unstable and therefore all the reagents and materials for its handling should be specially treated to remove possible RNAse activity. We have found that purified RNA is rather stable and, ironically, too much anti-RNAse treatment can become a source of problems. This especially applies to DEPC-treating of aqueous solutions, which often leads to RNA preparations that are very stable but completely unsuitable for cDNA synthesis. We have found that simple precautions such as wearing gloves (only for your protection from chemicals), avoiding speech over open tubes, using aerosol-barrier tips, and using fresh 1xTE (or 1xTHE) solution (or Milli-Q ultrapure BioPak water) for all solutions are sufficient to obtain stable RNA preparations.
      When an ultrafiltration cartridge (BioPak) is utilized at the point-of-use, the water is suitable for genomics applications (quality at least equivalent to DEPC-treated water) and cell culture. The BioPak cartridges has been validated in Millipore laboratories to warrant the production of pyrogen-free (less than 0.001 Eu/ml), RNAse-free (less than 0.01 ng/ml) and DNase-free (less than 4 pg/μl) ultrapure water, while maintaining both the .................More Read....

    By admin on 07 Ağustos 2011 | Biochemistry Protocols - Biyokimya Protokoller, Molecular Biology Protocols - Moleküler Biyoloji Protokolleri
    Etiketler:, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

    AMINO ACID ASSAY

    AMINO ACID ASSAY

    BY NINHYDRIN COLORIMETRIC METHOD

    Prepared by

    Nam Sun Wang

    Department of Chemical & Biomolecular Engineering

    University of Maryland

    College Park, MD 20742-2111

    ENCH485

    Method

    The reaction between alpha-amino acid and ninhydrin involved in the development of color are described by the following five mechanistic steps:

      alpha-amino acid + ninhydrin ---> reduced ninhydrin + alpha-amino acid + H2O

  alpha-amino acid + H2O ---> alpha-keto acid +NH3

  alpha-keto acid + NH3 ---> aldehyde + CO2

    Step (1) is an oxidative deamination reaction that removes two hydrogen from the alpha-amino acid to yield an alpha-imino acid. Simultaneously, the original ninhydrin is reduced and loses an oxygen atom with the formation of a water molecule. In Step (2), the NH group in the alpha-imino acid is rapidly hydrolyzed to form an alpha-keto acid with the production of an ammonia molecule. This alpha-keto acid further undergoes decarboxylation reaction of Step (3) under a heated condition to form an aldehyde that has one less carbon atom than the original amino acid. A carbon dioxide molecule is produced here. These first three steps produce the reduced ninhydrin and ammonia that are required for the production of color in the last two Steps (4) and (5). The overall reaction for the above reactions is simply (slightly inaccurately) expressed in Reaction (6) as follows:

    alpha-amino acid + 2 ninhydrin ---> CO2 + aldehyde + final complex(BlUE) + 3H2O

    In summary, ninhydrin, which is originally yellow, reacts with amino acid and turns deep purple. It is this purple color that is detected in this method.Ninhydrin will react with a free alpha-amino group, NH2-C-COOH. This group is contained in all amino acids, peptides, or proteins. Whereas, the decarboxylation reaction will proceed for a free amino acid, it will not happen for peptides and proteins. Thus, theoretically only amino acids will lead to the color development. However, one should always check out the possible interference from peptides and proteins by performing blank tests especially when such solutions are readily available. For example, one can simply add the ninhydrin reagent to a solution of only proteins and see if there is any color development. There is no excuse for failing to perform such a vital test when the sample mixture contains both proteins and amino acids. There are also reports that chemical compounds other than amino acids also yield positive results.

    This test can be used routinely for the detection of glycine in the absence of other interfering species. Although this is a fast and sensitive test for the presence of alpha-amino acids, because of the nonselectivity, it cannot be used to analyze the relative individual contents of a mixture of different amino acids. Furthermore, the color intensity developed is dependent on the type of amino acid. Finally, it does not react with tertiary or aromatic amines.

    Note that since ninhydrin is a strong oxidizing agent, proper caution should be exercised in handling this compound. It is especially potent at the elevated temperature under which the reaction is carried out. The ninhydrin reagent will stain the skin blue and cannot be immediately washed off completely if it comes in contact with the skin. However, as in any other stain on the skin, the color will gradually rub off after about a day.

    List of Reagents and Instruments

    A. Equipment

      Test tubes
      Pipets
      Spectrophotometer

    B. Reagents

      Ninhydrin Reagent Solution

        Ninhydrin: 0.35 g
        Add ethanol to: 100 ml (See Note 1.)

    Procedures

      Add 1 ml of the ninhydrin solution to 5 ml of sample. Cover the test tube with a piece of paraffin film to avoid the loss of solvent due to evaporation. A capped test tube can also be used instead.
      With gentle stirring, react at 80-100ºC for 4-7 minutes. (How would one find out the amount of time needed to ensure a complete reaction?) If a large heated water bath is used for the entire class and if there is no good provision for holding the test tube in the hot water bath, the test tube may be held with a piece of wire and hang on the side of the water container. A clamp usually does not work too well.
      After cooling to room temperature in a cold water bath, record the absorbance with a       .................More Read....

    By admin on 19 Temmuz 2011 | Biochemistry Protocols - Biyokimya Protokoller, Experimental Biochemistry - Deneysel Biyokimya
    Etiketler:, , , , , , , , , , , , , , , , , ,
    Pages: 1 2 3 4 ileri
    Older entries


    Biyokimyaci Dost Linkler
    Kongretr.com  | Forumakademi  | Biyokimyaci  | polymorphisms  | Fotoanaliz  |