Agaroz Jel Elektroforezi

A-Agaroz Jel Hazırlanması

1. Gerekli miktarda agaroz tartılır, erlene koyulur.
2. Gerekli miktarda TBE eklenir.
3. Hafifçe çalkalanıp mikrodalga fırına koyulur.
4. Mikrodalga fırın örnek kaynamaya başlayana kadar yüksek ayarda çalıştırılır.
5. Aralıklarla erlen mikrodalgadan çıkarılıp çalkalanır.
6. Kaynama başladıktan sonra mikrodalganın ayarı düşürülür. Tamamen eriyene
kadar çalkalanarak ısıtılır.
7. EtBr eklenir ve çalkalayarak tüm çözeltiye dağılması sağlanır.
8. Trayin çatlamaması için çözelti muslukta biraz soğutulur.
9. Traye yavaşça dökülür ve polimerize olması için en az 15 dakika beklenir.
B- Örneklerin Jele Yüklenmesi
1. Jel tanka yerleştirilir.
2. Tank jelin üstünü kapatacak kadar TBE ile doldurulur.
3. Küçük bir parça parafilm alınır ve yüklenecek örnek sayısı kadar yükleme
tamponu (yaklaşık 1’er μl) üstüne koyulur.
4. 5 μl örnek yükleme tamponu ile karıştırılıp jele yüklenir.
5. Bir kuyucuğa da markır koyulur.
6. 80 V da 20 dakika yürütülür.
TBE Tamponu AppliChem TBE Buffer 10X A3945
Agaroz AppliChem Agarose Low EEO A2114
EtBr Sigma Ethidium Bromide Solution E1385
Bromfenol Mavisi Sigma Bromphenol Blue B0126
Tris Sigma Trizma base T6066
Gliserol Fluka Glycerol 49767 .................More Read....

DNA İZOLASYONU

DNA’nın izolasyonunda çeşitli yöntemlerden yararlanılır. Genelde izole edilen kromozal veya plazmid DNA moleküllerinin saflığının kontrolü ve miktarının tayini spektral yöntemlerle yapılmaktadır.

SPEKTRAL YÖNTEMLER

Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm. Dalga boyundaki ışığı max. emme özelliği taşıdığından, bu dalga boyundaki emme derecesi nükleik asitlerin miktarının bir ölçüsüdür. Buna göre DNA’nın miktar ve saflığı,spektrofotometrede 260 ve 280 nm. Dalga boylarında elde edilecek değerlerden belirlenebilir. 1 optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50 μg/ml. tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml. ve oligonükleotidler için ise 20 μg/ml’ye karşılık gelmektedir.
Örneğin, izole edilen DNA çift iplikli ise,miktarının belirlenmesi için aşağıdaki formülden yararlanılır.

DNA(μg/ml) = 260 nm.deki OD x sulandırım oranı x katsayı (50)

ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER

DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber tüm laboratuvarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmentlerinin ayrılmasını sağlamaktır.
DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı, molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.
Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks) mekaniksel etkiyi engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için kullanılır. Matriks nişasta, poliakrilamid, agaroz veya agaroz akrilamid karışımı olabilir. Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentleri ve RNA moleküllerinin ayırımında kullanılır. Ancak poliakrilamid jelleri hazırlamak zordur ve uzun süre alır. Ayrıca uygulanacak DNA’nın yüksek konsantrasyonda olması olması gerektiğinden bu tip jellerin kullanılması pratik değildir. Bu nedenle rutin olarak en fazla kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir.
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ

Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür.
Ticari olarak üretilen agarozların saflık dereceleri farklı olabilmektedir. Bu durum DNA’nın göç hızını etkiler. Ayrıca kimyasal yapısı değiştirilerek düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz tipleride geliştirilmiştir. Bu agarozların ayırım gücü çok fazladır. DNA jelden geri kazanılacaksa bu tip agaroz uygun olur. Agaroz konsantrasyonu %0,5-1,5 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. Böylece küçük DNA fragmentleri için yüksek büyük DNA fragmentleri için ise düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde en uygun şekilde yürümesi sağlanır. DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm’de ışığı absorblaması sonucu fluerosan etki göstermesi ile olur.
İzole edilen DNA’nın genomik yada plazmid DNA’sı olmasına göre jeldeki görünümleri farklılık gösterir. Genomik DNA keskin bir bant ile bu bandın aşağı yukarı kısmına doğru biraz yayılan bir görüntü verir. Plazmid DNA ise genellikle DNA’nın üç farklı biçimi gözlenir. Plazmid DNA’sına ait süper sarmal biçim (form 1), gevşek sarmal biçim (form 2), ve doğrusal biçim (form 3). Molekül ağırlıkları aynı olmasına karşın bu üç formun jeldeki göçleri farklıdır. Bu farklılık agaroz konsantrasyonuna bağlı olmakla beraber uygulanan akıma, tamponun iyonik kuvvetine ve form 1’in yoğunluğuna da bağlıdır. Optimize olmuş koşullarda genellikle form1 diğerlerine göre daha hızlı hareket eder.
Jele fazla miktarda DNA yüklenmesi sonucunda kenar ve hız etkisi ile jelde yanlış yorumlara yol açabilecek görüntüler ortaya çıkabilir. Örneğin eğer fazla DNA yüklenirse keskin bir bant yerine yaygın bir görünüm meydana gelebilir. Bazen de jelin tamamında elektrik akımının aynı olmaması nedeniyle aynı DNA molekülleri jelin farklı bölgelerinde değişik hızda göç edebilir. Bu durum, düşük voltaj uygulamasıyla bir ölçüde ortadan kaldırılabilir. Ayrıca, örneğin içinde bulunduğu solüsyonun tuz konsantrasyonu da DNA’nın jelde yürümesini etkilemektedir.
GEREKLİ MALZEMELER

Agaroz

Tri-asetat (TAE) tamponu pH 8,0 (50x/litre)
242 g. .................More Read....

DNA İzolasyonu
Yöntemin prensibi: Hücrelerin lizis solüsyonu yardımıyla lize edilmesi, DNA, RNA
ve proteinlerin açığa çıkması, proteinlerin tuzla çöktürülmesi sonrasında DNA’nın
izolasyonudur.
Malzemeler
1. Lizis solüsyonu
0.5 M Tris-HCl pH 8.0,
20 mM EDTA
10 mM NaCl
1% SDS
0.5 mg/mL proteinase K
2. Doygun NaCl (6M)
3. Etanol (%96, %70)
Uygulama Basamakları
1. Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir
gece bekletilir.
2. 1 mL doygun NaCL eklenir.
3. Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir.
4. 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir.
5. Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır.
6. Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst
edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.
7. Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır.
Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
8. %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt
üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
9. DNA havada kurutulur.
10. Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10 dakika
tutulur.
11. Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran
>1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile
çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.
Kaynaklar:
1. Miller S.A, Dykes D.D, Polesky H.F.(1988). A simple salting out procedure for
extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16(3):1215
2. Tuo J, Jaruga P, Rodriguez H, Bohr VA, Dizdaroglu M. (2003) . Primary
fibroblasts of Cockayne syndrome patients are defective in cellular repair of 8-
hydroxyguanine and 8-hydroxyadenine resulting from oxidative stres. FASEB J. 17,
668–674.
3. Tuo, J., Mu¨ftu¨oglu, M., Chen, C., Jaruga, P., Selzer, R. R., Brosh, R. M., Jr.,
Rodriguez, H., Dizdaroglu, M., and Bohr, V. A. (2001). The Cockayne syndrome
group B gene product is involved in general genome base excision repair of 8-
hydroxyguanine in DNA. J. Biol. Chem. 276, 45772–45779 .................More Read....